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Laboratoire de clonage et de criblage des activités de bioconversion



Équipe LCAB
  Publications


La plateforme de clonage et de criblage enzymatique à haut débit a pour mission deux types de projets :

  o Projets « ORFéome » : construction d’ORFéome de bactéries (ORFeome d’Acinetobacter baylyi ADP1)
 o Projets « Biocatalyse » : recherche de biocatalyseurs par criblages à grande échelle de familles d’enzymes sur des panels de substrats potentiellement pertinents pour l’industrie

 
  Projet de génomique fonctionnelle à grande échelle

Il y a quelques années, le Genoscope a commencé à mettre à profit son savoir faire en matière de « haut débit », pour développer des outils permettant des études à grande échelle de « génomique fonctionnelle » à des fins de recherche fondamentale (enrichissement de la connaissance sur la fonction des enzymes) ou de découverte de nouveaux biocatalyseurs utilisables en industrie. Ce projet s’intègre dans le désir du Genoscope de contribuer activement et massivement à l’inventaire des réactions chimiques catalysées par des enzymes microbiennes (UMR8030 « Génomique métabolique »), dont les séquences s’accumulent dans les bases de données publiques.

D’autre part, les enzymes dont la fonction est déjà caractérisée ont le plus souvent été étudiées dans un contexte métabolique particulier. Or, il a été montré, à de multiples reprises, que les enzymes sont moins spécifiques vis à vis d’un substrat qu’on l’imaginait et qu’il n’est pas rare qu’une enzyme soit bi-fonctionnelle ou qu’un substrat puisse être pris en charge par plusieurs enzymes du métabolisme à spectre larges (exemple : les déshydrogénases). De plus, le criblage d’enzymes, même de fonction dite « connue », sur des substrats non naturels devrait accroître le catalogue de réactions possibles par les enzymes même si l’activité détectée est marginale. En effet, l’efficacité de ces enzymes peut ensuite être accrue par différentes méthodes d’évolution (mutagénèse, évolution de souches,etc.).
 
  Plateforme de clonage et de criblage enzymatique

Les enzymes candidates au criblage sont sélectionnées le plus souvent par homologie de séquences (homologies même faibles pour accroître la diversité) avec des protéines de référence (protéines connues pour réaliser une activité donnée).

Les gènes candidats sont amplifiés à partir de l’ADN de la collection de souches du Genoscope et du métagénome « Cloaca Maxima », puis clonés en format microplaque 96 puits selon une méthode de clonage qui s’affranchit des enzymes de restriction et de ligation (LIC).
  Les gènes clonés sont ensuite surexprimés dans E. coli BL21 en macroplaques 96 puits avant préparation des lystas cellulaires. Le criblage enzymatique de ces plaques s’effectue en format microplaque 96 ou 384 puits sur un panel de substrats.
  Cette plateforme, en activité depuis plus d’un an, a un débit actuel d’environ 5000 clonages/an.
 

mise à jour le 16 septembre 2014

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